La fondazione e la donazione del museo alla comunità di Grosseto sono legate alla figura del Canonico Giovanni Chelli (Siena 1809 - Grosseto 1869), un intellettuale senese dalle posizioni particolarmente progressiste per il suo tempo. Il primissimo nucleo del museo nacque in modo casuale dagli oggetti antichi che il canonico iniziò a disporre nella biblioteca da lui aperta al pubblico nel marzo del 1860; ma già nel corso dello stesso anno raccoglieva reperti archeologici con l'intenzione esplicita di creare un museo che andasse ad affiancare la biblioteca.

Nel 1923 assunse la carica di direttore della Biblioteca Chelliana, del Museo Civico e della Pinacoteca un altro ecclesiastico, Antonio Cappelli (Grosseto 1868-1939). Il suo primo atto fu di traslocare in quella che è ancora oggi la sede ufficiale della biblioteca e lo è stata fino al 1955 anche per il museo: il palazzo dell'ex seminario in Via Mazzini.

Ma l'archeologia era solo uno dei molti interessi di Antonio Cappelli; la passione che segnò gli anni della sua gestione fu un nuovo museo: il Diocesano d'Arte Sacra, inaugurato il 9 agosto 1933 nei locali ristrutturati e costruiti allo scopo sopra la sacrestia del Duomo.

I due musei ebbero una sede in comune solo nel 1975, nel palazzo tardo-ottocentesco dell'ex Tribunale di Piazza Baccarini, inaugurata nel corso del Congresso Nazionale dell'Istituto di Studi Etruschi e Italici di quell'anno.

Nel gennaio 1992 il Museo per irrinunciabili interventi di ristrutturazione è stato nuovamente chiuso. La riapertura, in una veste completamente rinnovata e con moltissimi nuovi depositi e acquisizioni degli scavi più recenti nel territorio, è del 21 marzo 1999.